Enrichment Strategies
富集方法对比
磷酸化肽段在蛋白酶解产物的总肽段池中丰度极低（通常不足 5%），因此在质谱分析前必须进行选择性富集。Aimsmass 实验室提供三种经过优化的主流富集策略，可根据样本类型和研究目标灵活组合。
TiO₂ 金属氧化物亲和层析
基于二氧化钛微球表面与磷酸基团之间的强 Lewis 酸碱配位作用实现选择性富集。在含 DHB（2,5-二羟基苯甲酸）或乳酸的加载缓冲液中，TiO₂ 对磷酸化肽段的选择性可达到 80% 以上。该方法操作简便、批次稳定性好，是目前大规模磷酸化组学研究中最常用的富集手段。对单磷酸化肽段富集效率高，但对多磷酸化肽段可能存在偏好性不足。
操作简便高通量兼容单磷酸化偏好
Fe-IMAC 金属螯合亲和层析
利用固定在螯合配体（如 NTA、IDA）上的 Fe³⁺ 或 Ga³⁺ 离子与磷酸基团配位。改进型 High-Select Fe-NTA 磁珠在有机溶剂条件下显著提高了选择性，对多磷酸化肽段（含 2 个及以上磷酸基团）的富集效率优于 TiO₂，二者互补使用可将磷酸化位点总覆盖度提升 20–35%。也适用于微量样本（低至 10 μg 肽段起始量）。
多磷酸化偏好微量兼容与 TiO₂ 互补
磷酸化特异性抗体免疫沉淀
利用针对特定磷酸化基序的单克隆抗体（如抗 pY-100、抗 pTP、抗 pSPxK）进行免疫沉淀富集。对于酪氨酸磷酸化研究，由于其丰度仅占总磷酸化的 0.1–1%，抗体法是唯一可行的大规模富集手段。4G10 和 PY20 是两种常用的广谱抗 pY 抗体，可鉴定数百个酪氨酸磷酸化位点。缺点是抗体成本较高，且仅限于抗体识别的特定基序。
pY 必需motif 特异性高成本
| 参数维度 | TiO₂ 亲和层析 | Fe-IMAC 螯合层析 | 抗体免疫沉淀 |
|---|---|---|---|
| 选择性（特异性） | ~80%（含 DHB 竞争剂） | ~85%（有机相优化后） | >90%（pY 抗体） |
| 多磷酸化肽段偏好 | 中等（单磷酸化略优） | 强（多磷酸化显著优势） | 取决于抗体基序 |
| 最低起始量 | 50–100 μg 肽段 | 10–50 μg 肽段 | 200–500 μg 肽段 |
| 典型位点鉴定数 | 12,000–18,000 / 针 | 10,000–15,000 / 针 | 200–800 pY 位点 / 针 |
| 批次稳定性 | 优异（CV < 10%） | 良好（CV < 15%） | 中等（受抗体批次影响） |
| 适用场景 | 全细胞裂解液、组织 | 微量样本、多磷酸化 | 酪氨酸磷酸化、特定 motif |
| 串联使用建议 | TiO₂ + Fe-IMAC 串联富集可覆盖度提升 20–35%，推荐用于追求最大深度的发现型项目 | ||
关于 TiO₂ 和 IMAC 两种方法更深入的实验条件对比和数据分析，请参阅我们的方法学博客文章 《TiO₂ vs IMAC：磷酸化富集策略的系统性对比》，其中包含了基于本实验室 50+ 个项目的实际数据比较。
