琥珀酰化修饰（Succi）技术页

什么是琥珀酰化修饰？

琥珀酰化（Succinylation）是一种发生在赖氨酸（Lys, K）残基 ε-氨基上的新型酰基化修饰，化学结构上由琥珀酰辅酶 A（Succinyl-CoA）将琥珀酰基（-CO-CH₂-CH₂-COO⁻）共价连接到赖氨酸侧链，引入 +100.04 Da 的质量标签（精确质量增加 100.0160 Da）。该修饰由 Xie et al. (2012, Molecular & Cellular Proteomics) 首次在 HeLa 细胞和 S. cerevisiae 中通过质谱系统鉴定并命名。

不同于乙酰化（+42.01 Da）等短链酰基化，琥珀酰化带有 负电荷的羧基末端，可引发赖氨酸残基的电荷翻转与空间构象显著改变，能更强烈地改变蛋白质的物理化学性质与生物学功能。琥珀酰辅酶 A 来自三羧酸（TCA）循环、有机酸代谢及支链氨基酸代谢，因此琥珀酰化被视为细胞代谢状态与翻译后修饰调控之间的直接化学桥梁。

化学结构与质量标签

修饰位点：赖氨酸（Lys, K）ε-氨基，少量见于组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸（位点研究仍在扩展）
质量标签：单同位素 +100.0160 Da（精确）/ 平均质量 +100.04 Da
化学基团：-CO-CH₂-CH₂-COO⁻，末端游离羧基带负电
电荷效应：中性赖氨酸（+1）→ 琥珀酰化后（0/-1），为最显著的"电荷翻转"酰基修饰之一
可逆性：由琥珀酰基转移酶（KAT2A/GCN5、p300、CBP）和去琥珀酰化酶（SIRT5、SIRT7）动态调控

主要生物学功能

代谢调控：琥珀酰化在肝脏、肾脏、心肌、骨骼肌等高代谢组织中富集，直接响应饥饿、禁食、高脂饮食、运动等代谢压力
酶活性调节：谷氨酰胺脱氢酶（GDH）、丙酮酸脱氢酶（PDH）、丙酮酸脱氢酶 E1 亚基（PDHA1）、酮戊二酸脱氢酶（OGDC）的活性被琥珀酰化强烈调节（均通过 SIRT5 去琥珀酰化激活）
线粒体功能：三羧酸循环酶、电子传递链复合物（NDUFA5、SDHA）、ATP 合酶等线粒体蛋白被高度琥珀酰化
表观遗传：组蛋白（H3K79、H3K122、H4K77、H4K91 等）琥珀酰化参与转录激活与染色质开放
疾病相关：肿瘤、心血管病、肾损伤、神经退行性疾病、非酒精性脂肪肝等

研究意义与应用方向

琥珀酰化作为携带电荷的代谢-表观"开关"，已成为连接代谢异常与表观遗传紊乱的核心枢纽修饰，近年高影响力研究持续涌现：

肿瘤代谢重编程：2024 年 Nature Communications（15:4642）、Cell Metabolism 多次报道 KAT2A/p300 介导的组蛋白琥珀酰化驱动肝癌、结直肠癌、胰腺癌代谢-表观协同促癌
线粒体疾病：琥珀酰-CoA 蓄积导致非酶促超琥珀酰化（non-enzymatic succinylation），是 LIPT2、PDSS2 等基因缺陷的核心机制
心脏代谢：缺血-再灌注损伤中 SIRT5 缺失导致超琥珀酰化诱导心肌细胞凋亡
神经免疫：小胶质细胞激活、阿尔茨海默病模型中发现 H3K79suc 富集于炎症基因启动子
干细胞命运：琥珀酰化梯度调控造血干细胞与胚胎干细胞的多能性退出

配合 Aimsmass 的客户案例与合作文献，可为代谢性疾病、肿瘤、心血管和神经退行性疾病课题提供完整修饰组学证据链。

琥珀酰化修饰组学技术流程

1. 样本制备与蛋白提取

适用样本：细胞、动物组织（肝/心/肾/脑/肌肉等）、体液、外泌体、类器官、临床穿刺样本
推荐样本量：≥ 1×10⁷ 细胞 / ≥ 200 mg 组织 / ≥ 1 mg 总蛋白
裂解液：8 M 尿素 + 1% SDS + 蛋白酶抑制剂 + 去乙酰化酶抑制剂（Trichostatin A、Nicotinamide）
关键步骤：超声破碎 → 还原（5 mM DTT）/烷基化（15 mM IAA）→ 丙酮沉淀 / 滤膜辅助样品制备（FASP）

2. 蛋白酶解

酶：胰蛋白酶（Trypsin），1:50（酶:蛋白，w/w）
酶解条件：37°C 16 h，pH 8.0
肽段脱盐：C18 Sep-Pak 柱，60% ACN 洗脱，真空干燥

3. 琥珀酰化肽段富集（抗体亲和）

琥珀酰化修饰在蛋白质组中通常亚化学计量存在（占总赖氨酸 < 1%），必须先富集后质谱。

抗体：兔抗 K-Succinyl 抗体（Aimsmass 内部货号 AM10412，可外购）
琼脂糖珠偶联：共价偶联 Protein A/G 琼脂糖，抗体重链/轻链污染可控
富集流程：肽段溶于 IP 缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl）→ 与抗体珠 4°C 旋转孵育 2 h → 洗涤 3 次（高盐+低 pH）→ 0.1% TFA / 50% ACN 洗脱两次
富集效率评估：Western blot 比对 input / unbound / eluate，三明治验证 K-succinyl 信号

4. LC-MS/MS 鉴定（DDA / DIA 双模式可选）

平台一：Thermo Exploris 480 + nano-HPLC（EASY-nLC 1200），DDA 模式，NCE 28 分步 HCD，120 K 分辨率
平台二：Bruker timsTOF HT + nanoElute，DIA 模式，PASEF 启用，扫描窗口 25 m/z
色谱柱：25 cm × 75 μm C18 反相柱（1.9 μm 颗粒，IonOpticks），90 min 梯度（5-35% ACN）
进样量：~1 μg 修饰肽段 / 进样

5. 数据库检索与定性定量

搜索引擎：MaxQuant 2.4 / Proteome Discoverer 3.0 / MSFragger
数据库：UniProtKB / NCBI nr + 反库，物种按客户提供设定
可变修饰：赖氨酸 +100.0160（Succinyl），固定修饰：半胱氨酸 +57.021（Carbamidomethyl）
位点定位：PTMLoc / Ascore > 13（P < 0.05）
定量：Label-free（DDA 强度）/ DIA-NN 自动谱图提取（DIA）/ TMT 11-plex（可选）

6. 生物信息学分析交付

修饰位点分布：motif（±7 残基）、二级结构域、K 周边序列保守性
亚细胞定位：基于 UniProt 注释的核/胞质/线粒体定位比例
功能富集：GO BP / MF / CC、KEGG、Reactome（DAVID + clusterProfiler 双校验）
蛋白质相互作用网络：STRING ≥ 0.7 高置信，CytoHubba 拓扑拓扑关键节点
差异修饰位点：log2FC ≥ 1 + p < 0.05（t 检验 + BH 校正），火山图、热图、PCA
跨数据集联合分析：琥珀酰化 - 乙酰化 - 磷酸化 crosstalk（竞争位点）
靶点预测：基于机器学习（XGBoost + 序列特征）的疾病关联优先级排序

环节	关键指标	Aimsmass 标准
蛋白提取	总量 / 完整性	≥ 1 mg / SDS-PAGE 主带清晰
酶解效率	漏切位点比例	< 15%
抗体富集	修饰肽段占比	≥ 70%（eluate / 总肽段）
质谱灵敏度	鉴定到的修饰位点数	≥ 6 000 位点 / 2 000 蛋白（HEK293T 参考）
位点定位	PTM 评分阈值	Ascore ≥ 13 / P < 0.05
定量重现性	CV (蛋白 × 样品)	< 15%（技术重复）
缺失值比例	数据矩阵完整度	≥ 80% 有效值

技术优势与差异化

双平台互验：DDA（Exploris 480）+ DIA（timsTOF HT）双轨迹并行解析，兼顾深度与定量稳定性
交叉修饰解卷积：琥珀酰化（+100）与磷酸化（+80）、泛素残基（GlyGly, +114）会出现共定位质量干扰，本平台使用 5 ppm 双窗口 + 高分辨率消除误判
抗体验证闭环：琥珀酰化抗体（AM10412）同步提供 WB / IP 用量，可与磷酸化、乙酰化形成多修饰并行检测
合规文件：提供 BSA 圈定标准曲线 + 全程仪器 raw 文件，符合 MIRAGE 与 Creative-Proteomics 同等的数据透明原则
伦理合规：可对接人类遗传办 HGRAC、人遗保藏审批、临床样本知情同意核对

适合的应用场景

代谢-表观遗传双向调控机制研究
肿瘤（肝癌/胃癌/结直肠癌/胰腺癌/肺癌）琥珀酰化图谱绘制
线粒体功能障碍（PDSS2、LIPT2、ETHE1 缺陷）模型鉴定
心肌缺血再灌注、SIRT5 调控
脂肪肝、糖尿病性肾病的代谢靶点筛选
神经炎症、小胶质细胞激活的代谢-表观耦合研究

琥珀酰化修饰（Succinylation）蛋白质组学