二硫键鉴定（Disulfide Bond）蛋白质组学

什么是二硫键？

二硫键（Disulfide bond, S-S）是一种发生在两个半胱氨酸（Cys）巯基（-SH）之间的氧化偶联修饰，两 Cys 在失去 2 个氢原子后形成共价 S-S 键，质量变化 -2.01565 Da（精确质量减少，平差 -2.016 Da）。形成的二硫键可以是：

• 链内二硫键（Intra-disulfide）：同一多肽链内两个 Cys 形成
• 链间二硫键（Inter-disulfide）：不同多肽链间 Cys 形成（免疫球蛋白、分泌酶等）
• 三体二硫键：罕见但存在于 VEGFA、HGF 等多聚体

二硫键在 ER / 高尔基体中由 Ero1 / PDI 系统催化形成，是许多分泌蛋白、膜蛋白结构稳定性的关键。抗体药物（如 mAb）必须精准维持特定二硫键配对，否则丧失结合活性。

化学与生物学

• 位点：Cys 巯基 -SH（必须两个 Cys 配对，配对位点不确定）
• 质量标签：-2.01565 Da（精确）/ -2.016 Da（平均），仅当两 Cys 配对
• 化学键：S-S 共价键，长度 2.05 Å
• 关键酶：内质网 Ero1α/β（氧化）+ PDI（蛋白二硫键异构酶）
• 还原路径：细胞质中 Trx / Grx 系统主动还原，使胞内 Cys 维持还原态

关键功能

1. 抗体药结构：mAb 4 对链内 + 4 对链间（hinge）二硫键，是抗体生产关键质控
2. 胰岛素：胰岛素 A 链-B 链形成 2 对链间二硫键
3. 病毒包膜糖蛋白：SARS-CoV-2 Spike / HIV gp120 等通过二硫键维持构象
4. 酶结构：tPA、uPA、组织蛋白酶抑制剂等的稳定性
5. 折叠病：二硫键错误配对是淀粉样变性、朊病毒病的重要机制

二硫键鉴定技术流程

1. 非还原电泳 + 蛋白胶内酶解（核心）

• 烷基化抑制：无 IAM / IAA 烷基化，避免伪还原
• 非还原 SDS-PAGE：110 mM 未还原胶，观测二聚 / 单体比
• 胶内酶解：胰蛋白酶 37°C 过夜，肽段抽提
• 搜索：片段按"两支 Cys -2.016 Da 同时修饰"做可变修饰

2. LC-MS/MS

• 平台：Thermo Exploris 480 / Bruker timsTOF HT
• 分辨率：MS1 60K / MS2 30K
• 关键搜索模式：链内二硫键（同一肽段两个 Cys 共带 -2.016）/ 链间二硫键（两肽段共带 -2.016）

3. 二硫键绘图软件

• DisoLink、DisulfideDetect、pLink 2、StitchLink 4
• Aimsmass 默认 pipeline：pLink 2（链间二硫键最优解）+ DisoLink（链内）

4. 关键分析

• 二硫键配对图（PDI 中间体、二聚体）
• 与 AlphaFold 预测 disulfide 比较
• 还原/氧化处理对照（DTT / IAA）