次磺酸化修饰（Sulfenylation）蛋白质组学

什么是次磺酸化？

次磺酸化（Protein Sulfenylation, Cys-SOH）是发生在半胱氨酸（Cys）巯基（-SH）上的可逆 ROS 氧化修饰，巯基被氧化为次磺酸（-SOH），引入 +15.9949 Da（精确质量增加，平差 +15.99）质量标签。是蛋白氧化的第一阶段产物，可进一步被氧化为亚磺酸（-SO₂H, +31.99 Da）或磺酸（-SO₃H, +47.98 Da）。

Cys-SOH 是氧化应激信号的主要载体，2004 年研究证实其作为 PTM 而非简单氧化副产物。后续分别发现其参与：

• H₂O₂ 信号传递（Src、PTEN、PTP1B、Caspase-3）
• ROS 感受器（KEAP1、TRPA1）
• 二硫键形成的可逆中间体
• PTP 酶活性负调控

关键化学与生物学

• 位点：Cys 巯基（要求低 pKa ≤ 5.0，常出现在 PTP active loop、ZnF-SAM、kinase）
• 质量标签：+15.9949 Da（Cys-SOH）/ +31.9898 Da（Cys-SO₂H）/ +47.9847 Da（Cys-SO₃H）
• 化学：次磺酸 -SOH，亚稳态（半衰期 ~ 5-30 min），可与其他 Cys 反应形成二硫键
• 写入：非酶促（被 H₂O₂ 等 ROS 直接氧化）
• 去除：还原酶（Thioredoxin、Glutaredoxin）将 SOH 还原回 SH

关键功能

1. H₂O₂ 信号：2011 Nature 报道 PDGF 诱导 PTP1B-SOH 形成，激活下游 PDK/Akt
2. Nrf2 激活：KEAP1 Cys-SOH / Cys-SO₂H 释放 Nrf2，启动抗氧化反应（ARE）
3. 金属蛋白酶：ADAM17、Notch 通过 Cys-SOH 切割底物
4. 炎症：NLRP3 炎症小体通过 Cys-SOH 受 ROS 调控
5. 血管：PKG1 Cys-SOH 形成二聚体激活血管扩张

次磺酸修饰组学技术流程

1. Dimedone 化学探针策略（核心）

• Dimedone（5,5-二甲基-1,3-环己二酮）：特异性与 Cys-SOH 形成稳定共价加成物，质量 +138.07 Da
• 工作流程：①细胞 H₂O₂ 处理 / 基础 ROS ② 加入 1 mM dimedone 4°C 30 min ③ 蛋白提取 / 酶解 ④ 抗 dimedone 抗体 IP 富集 ⑤ LC-MS/MS
• 关键：实验全程不加 IAM / DTT 还原，避免将 SOH 反向还原

2. 其他化学探针

3. LC-MS/MS

• 平台：Thermo Exploris 480
• 分辨率：MS1 60K
• 修饰变量：Cys +138.07（dimedone probe）/ +15.99（SOH 氧化）/ +31.99（SO₂H）

4. 关键分析

• KEGG：ROS / Oxidative stress / HIF-1 signaling
• Cys 微环境分析（近邻 Gly、His、Asp 的 pKa 调控）
• 氧化还原状态时序